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基于微流控技术实现严格厌氧条件下的细菌单细胞培养与实时观测

来源:SCI期刊网 分类:农业论文 时间:2021-10-15 08:26 热度:

摘 要:摘要当下微生物研究存在两个趋势,一是随着大量肠道微生物相关研究的开展,研究者们越来越认识到肠道微生物尤其是大量厌氧菌与人类健康息息相关,因为肠道本身在某种程度上也

  摘 要 当下微生物研究存在两个趋势,一是随着大量肠道微生物相关研究的开展,研究者们越来越认识到肠道微生物尤其是大量厌氧菌与人类健康息息相关,因为肠道本身在某种程度上也属于厌氧环境,故对肠道细菌的细胞生理学研究需要建立在厌氧培养环境的基础之上;二是仅依靠经典的微生物群体培养方法已经难以满足对细胞异质性的研究,需要发展多种方法在单细胞水平进行细菌生理学研究,以此深入研究被细胞群体所掩盖而被研究者忽略的生理规律。该研究开发了一种微生物在厌氧条件下的培养方法,包括相关培养装置设计与相应的实验方法流程,在稳定维持培养环境严格厌氧程度的基础上,使用微流控芯片对细菌进行长时间的单细胞培养,同时结合高分辨率显微镜延时成像技术,在培养的同时实现对生长动态的实时观测与数据采集。该方法为细菌细胞在厌氧条件下的单细胞分析提供了有力的技术支持。

基于微流控技术实现严格厌氧条件下的细菌单细胞培养与实时观测

  关键词 微流控;厌氧培养;细菌生理学;单细胞分析

  1引言

  近年来,得益于DNA测序技术的不断迭代优化,微生物组研究取得了蓬勃发展[1]。微生物培养方法是微生物相关研究的绝对基础,是不可绕开的关键一环[2]。传统的微生物培养方法包括选择培养法、平板单克隆培养法、基于密度/细胞尺寸筛选法和有限稀释法等,均为微生物实验室的常用基础方法。微生物学家通过各种培养方法能够获得特定细胞株系的纯培养,进而为各种细胞生理学实验提供准确而充足的研究对象。但由于某些微生物相关培养方法的缺失,大大阻碍了研究者对其一些基本属性的认知,进而影响到相关生态以及生物学现象的研究[3]。

  传统细菌培养方法所得到的纯培养物,理论上应是来源于同一菌株,几乎不存在明显的遗传变异[4],通过对其进行测量能够获得许多生理学参数,包括生长速率、死亡率、细胞尺寸分布和基因表达强度等,也能够获得类似Monod方程这样对工业生产有着一定指导意义的经验公式[5]。而随着对细胞生理状态噪声与随机波动相关研究的逐渐深入[6-7],研究者们越来越意识到细胞异质性的存在与重要性[8],即从某种角度来讲每个单细胞都可能与其他细胞有所区别。若要对细菌进行单细胞水平的培养与研究,则传统的群体培养方法已不能满足要求,需要开发新的实验培养技术[2]。

  在细菌单细胞水平进行生理学研究的重要技术手段之一是利用基于微流控技术的高分辨显微镜延时拍摄方法[9]。其中,微流控技术可以实现单细胞培养,并且有着高度的可设计性和对实验条件的可控性[10];而显微镜延时拍摄方法则是在不影响细胞生理活动的前提下,实时采集各种参数,与“下一代细菌生理学技术”的理念高度符合[11]。目前相关技术的报道仍主要集中于常规条件的有氧培养,对于与人类健康息息相关的大量厌氧菌与兼性厌氧菌的厌氧生理学的研究则相对较少。该技术的主要难点在于既要确保培养装置的气密性,又要将整个培养系统(包括微流控装置、气体控制装置等)与相关商业化显微镜进行适配。此外,由于厌氧条件下细菌生长相对较慢[12],需要确保整个系统能够长期稳定的运行。

  本研究提供了一种厌氧微生物培养与实时观测装置。该装置包括:底座、上盖、微流控芯片和培养液储存室。其中,培养装置上盖水平面上设有亚克力板或玻璃板视窗,与微流控芯片底部盖玻片相对设置,便于显微成像;培养基储液池上设有出液孔,可与微流控芯片相连为细胞培养提供充足的营养;培养装置上盖的侧壁上设有气体入口、气体出口和出液口,以便维持培养装置内的厌氧氛围、气压稳定以及液体的流通。该装置具有优异的气密性,能够为厌氧微生物提供长时间稳定的厌氧气体氛围且气体氛围可控;同时可以满足高通量、大范围多位点采样,高放大倍数拍摄等实验需求。

  2材料与方法

  2.1实验材料与主要设备

  2.1.1实验试剂

  微流控芯片制作所用的材料与试剂如表1所示;细菌培养所用的材料与试剂如表2所示;单细胞实验所用的材料与试剂如表3所示。

  2.1.2实验仪器与设备本实验使用的仪器与设备如表4所示。

  2.1.3实验菌株本实验使用的菌株如表5所示。

  2.2实验方法

  2.2.1微流控芯片的设计

  本实验所使用的微流控芯片被称为母细胞芯片(MotherMachine)[14],即指其关键功能在于将细菌许多单个母细胞(MotherCell)保持在固定位置持续生长,具体设计如图1所示。其中,图1(a)中单细胞生长通道总数4000,宽度为0.8~2.6μm(以0.2μm的梯度增加),高度为1.2μm,长度为25μm;培养基通道宽度为100μm,高度为100μm,箭头表示其中液体培养基流动。采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的芯片整体封接在盖玻片(尺寸24mm×50mm)上,具体内部结构处于PDMS与盖玻片之间:细菌细胞单层生长于较窄、较低的众多生长通道内,这些单细胞生长通道一端为封闭端,另一端开口与更宽、更高的培养基通道相接,培养基通道两侧开头通过持续不断的液体培养基流动,以及营养物质的扩散作用,为单细胞生长通道内的细胞提供源源不断的营养成分。在营养充分的条件下,通道内的细菌细胞随着时间推移逐渐沿着生长通道分裂生长为一条线,多余细胞通过分裂生长自然伸出生长通道,被培养基通道内的高速液体流动冲走。此时,处于生长通道封闭段的母细胞在微流控芯片内的相对位置不变,其营养条件也是稳定的,因而整个微流控芯片设计可被看作一种单细胞水平的微量培养恒化器。

  2.2.2硅片模板

  (1)单细胞生长通道的制作

  a.准备76.2mm的硅片,用低强度等离子处理30min。

  b.从冰箱中取出SU-82002光刻胶和SU-82000.5光刻胶,待光刻胶温度与室温一致时,按V(SU-82002)∶V(SU-82000.5)=8∶2(体积比)将两种胶在离心管中混匀。

  c.设定匀胶机程序:预甩600r/min,9s;匀胶4000r/min,30s。

  d.将表面洁净的硅片置于匀胶机吸盘上,在硅片上添加室温混合胶2mL,运行程序。

  e.将硅片置于平整的热板上95℃烘2min。

  f.在曝光机的吸盘周围套入橡胶圈,将第一层铬板掩膜清洁干净后放在台架上(镀铬面向下),并开启真空,将一块较大的锡箔纸盖在掩膜上。

  g.将硅片放在吸盘上,待冷却后推入(记录此时硅片的位置,确保在后续可以对准结构)。

  h.上升吸盘,用锡箔纸遮盖,执行真空曝光,观察真空表读数——如果漏气,则复位吸盘后再次上升,确保橡胶圈与掩膜贴合良好不漏气。

  i.曝光量为70mJ/cm2,需要根据曝光机的功率调整曝光时间。其中,预设曝光时间应长于真实曝光时间(如需曝光4s,则设置30s曝光时间)。启动曝光时先用锡箔纸遮挡,当剩余时间等于需曝光时间时,快速撤下锡箔纸,结束曝光。

  j.曝光后于95℃烘1min,取下硅片,冷却。

  k.用丙二醇甲醚醋酸酯(PM)显影液显影;随后用异丙醇冲洗残留显影液,接着用氮气吹干表面,于体视显微镜下观察显影效果。

  l.若显影后结构清晰,则用烘箱180℃坚膜1h,否则重复上一步。

  m.冷却后取出,用台阶仪测量子通道高度并记录。

  (2)培养基通道的制作

  整体实验流程与上部分单细胞生长通道的制作相同,但需要修改一些具体的实验参数:使用SU-83025光刻胶,离心3000r/min,前烘30min,需要进行校准使其与第一层对齐,曝光量为150mJ/cm2,后烘5min。

  2.2.3PDMS芯片制作

  (1)固定硅片模板

  a.将硅片模板用透明胶贴在玻璃板中间(勿贴到结构),同时在玻璃板四周竖着贴上锡箔胶带密封,防止倒入PDMS单体后在热固化时泄漏;

  b.将PDMS单体和引发剂以10∶1的质量比混合,搅拌(5min)均匀,然后抽真空15min,再用洗耳球吹除表面剩余气泡;

  c.将上一步无气泡PDMS与引发剂的混合液体,适量倒入第(a)步制作好的贴有硅片模板的玻璃板容器内,放入烘箱内的水平台上,80℃、烘30min以上。

  也可以直接用无尘胶带将模板贴到玻璃板容器中间后,直接倒入PDMS和引发剂进行PDMS芯片固化。

  (2)PDMS芯片固化

  a.将PDMS单体和引发剂以10∶1的质量比混合,搅拌(5min)均匀后抽真空(10min),最后用洗耳球吹除表面剩余气泡;

  b.根据硅片模板表面积及所需微流控芯片厚度计算PDMS和引发剂混合液体用量(这里芯片厚度约为5mm,PDMS和引发剂混合液体需22g左右),倒在硅片模板上,整体放入烘箱,80℃烘1h以上。

  (3)PDMS芯片切割

  使用手术刀将固化好的芯片从硅片模板上切下,注意不要太靠近芯片结构,刀落到硅片上,切到底可见空气进入的痕迹,然后将芯片放在LED灯上进一步切割。

  (4)PDMS芯片打孔

  将PDMS芯片放在LED灯上操作,选择合适孔径(这里为0.8μm)的打孔器从结构面向下打,拔出时要小心缓慢,可双向旋转拔出,注意不要裂口,然后用氮气气流清理打好的孔(注意打孔器的针头最好频繁更换,以避免打孔时产生过多的PDMS碎屑对单细胞培养时产生堵塞通道,可在正式打孔前测试一下)。

  (5)PDMS芯片与盖玻片封接

  a.先用异丙醇清洗盖玻片,然后氮气吹除异丙醇液体;

  b.用无尘胶带粘去PDMS芯片结构面灰尘及碎屑;

  c.将盖玻片和PDMS芯片结构面向上放置,一起进行等离子清洗——HI档(18W,气压266Pa,气流25mL/h),2min(等离子处理时间可调整,一般不要超过2min);

  d.PDMS芯片依靠重力贴在玻璃板上(多块芯片考虑排布以合理利用空间),若贴合过程迅速则表明等离子处理后PDMS芯片和盖玻片表面性质良好;

  e.贴合后的芯片放入烘箱80℃烘10min。

  (6)通道修饰及镜检a.将已过滤除菌的1%F-127水溶液,通过培养基通道入口缓慢注入芯片(戴护目镜),修饰至少30min;b.10倍镜或20倍镜下检查芯片通道(是否完好)、打孔及封接情况,无误后放入厌氧工作站。

  2.2.4单细胞实验

  (1)细菌培养与预处理

  在厌氧箱内进行平板划线,挑选5个单菌落于3mL液体培养基内进行活化过夜,过夜培养所得的菌液与培养基按1∶100转接至120mL培养基培养至对数后期。用封膜封住离心管口后,将菌液以5000r/min离心10min。倒出上清液,重悬沉淀再次离心,以5000r/min离心5min。使用含0.01g/mLF-127的上清液重悬菌体,涡旋混匀。其中,固体培养基为LB琼脂(E.coli)和BHI琼脂(B.fragilis),液体培养基为RDM+glucose(E.coli)和BHIS(B.fragilis)。

  (2)细菌装载

  将混匀的浓缩菌液注入芯片,采用无尘胶带贴上芯片出入口,将芯片固定在培养皿内,封膜,以2000~2500r/min离心5min。在厌氧工作站内将芯片固定于自制厌氧培养盒内,密封好后架设到显微镜上,连接气路和液路。

  (3)单细胞延时拍摄

  待厌氧盒内氧气指示剂保持粉色,使用100×油镜观察荧光场——若无可见荧光激发(E.coli),则开始选点进行延时拍摄。实验完成后,使用自主研发的相关软件进行图像处理与数据分析。

  3实验结果

  3.1厌氧程度评估

  本实验体系的关键点在于单细胞培养时厌氧条件的维持,这里从培养气体氛围与细胞学水平证据(荧光蛋白激发)来进行评估。

  3.1.1气体氛围

  厌氧培养盒在实验中会持续通入厌氧混合气——95%N2+5%CO2,以营造并长期维持盒内厌氧环境。其中,N2为模拟空气主要成分,生理意义不大,一定浓度的CO2为细菌正常生长所必需[15]。该气体组成与常用的厌氧工作站基本相同,只是缺少H2,而H2在厌氧工作站的主要作用是便于在催化装置的作用下与O2反应生成H2O以达到除氧的目的,但由于厌氧培养盒并不像厌氧工作站一样体积巨大,需要时常取放实验物品或者进行实验操作而出现O2进入的风险;反之,厌氧培养盒具有优秀的气密性,并且在整个厌氧培养实验中一直维持密封,整体组装也在厌氧工作站内进行,故无需除氧。

  实验中,厌氧培养盒内放置有氧气指示剂,当盒内气体氛围达到厌氧状态时,氧气指示剂会维持粉色(图2),表明此时厌氧培养盒内气体中O2浓度低于检测下限(≤0.1%)。这种状态会在厌氧盒密封并持续通入厌氧混合气时长期维持,只有在实验中切换所通入的气体,将厌氧混合气换成压缩空气时,指示剂才会较快地变为蓝紫色(超过检测上限0.5%),表明厌氧培养盒内气体中的氧气浓度迅速提升至与空气相同。

  3.1.2细胞水平

  在细胞学水平,本实验采用荧光蛋白作为严格厌氧指示剂。荧光蛋白基因位于细菌染色体上,属于组成型表达基因,这意味着荧光蛋白在稳态生长的细菌细胞中始终处于动态平衡状态[16]。而作为常规的荧光蛋白,其成熟发光除了特定光激发之外,还有一个基础条件就是氧气的存在[17],除非是特定改造专门适用于厌氧环境激发的荧光蛋白[18]。

  如图3(d)所示,在有氧培养下,微流控芯片中细菌细胞表达的荧光蛋白受激发产生明显的荧光;而在厌氧培养下,虽然对明场延时拍摄图片的分析表明细菌细胞生长状态稳定(图4(b),左半部分),但是细胞中的荧光蛋白在相应波长激发光激发下,并无明显的可见荧光产生(图3(b),LUTs打开增强敏感度,故视野并非黑白),说明此时细胞内氧气浓度不足以保证荧光蛋白成熟而受激发光。Hansen等[17]研究表明,1×10-7浓度的溶解氧足以使荧光蛋白受激发产生荧光,而2.5×10-8浓度的溶解氧则不足以支持荧光蛋白受激发而发光。本实验结果表明,在厌氧培养盒持续通入厌氧混合气进行厌氧培养时,微流控芯片内溶解氧浓度至少低于1×10-7,达到了优秀的严格厌氧程度,完全满足兼性厌氧菌与严格厌氧菌的厌氧培养,实际上0.1%的氧气组成已不会对一些严格厌氧菌的正常生长产生影响[12]。

  3.2细菌单细胞稳定生长

  在单细胞实验完成后,采用自主研发的分析程序进行图像分析与数据处理。通过对大量单细胞的生长速率进行分析可知(图4):对于严格厌氧菌(B.fragilis),此实验方法可以保证其长期稳定地进行生长与分裂;对于兼性厌氧菌(E.coli),此实验方法既可以提供厌氧环境确保厌氧稳定生长,又可以将通入的厌氧混合气改为空气使其实现常氧生长。——论文作者:马智鑫1,2 邓宇芳1 于 跃1 李思宏1 梁 帆1 夏 霖1* 黄术强1*

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文章名称:基于微流控技术实现严格厌氧条件下的细菌单细胞培养与实时观测

文章地址:http://www.sciqk.com/lwfw/nylw/12015.html

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