油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的检测方法及加工条件对其生成的影响

来源：SCI期刊网 分类：农业论文 时间：2021-09-30 08:13 热度：

摘 要：摘要：杂环胺是肉类等富含蛋白质的食物在热加工过程中常产生的一类具有强致癌性、致突变性化合物，通过选择合适的烹调方式和加工条件能够一定程度的减少杂环胺的生成。本文建

　　摘要：杂环胺是肉类等富含蛋白质的食物在热加工过程中常产生的一类具有强致癌性、致突变性化合物，通过选择合适的烹调方式和加工条件能够一定程度的减少杂环胺的生成。本文建立了一种同时测定油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法，并研究了加工条件对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响。结果表明，待测杂环胺的最优提取和净化条件为：1mol/LNaOH溶液-乙腈提取、添加1.5gNaCl、StrataTM-X-C柱净化、90:10(V/V)的甲醇-氨水洗脱。6种杂环胺在相应的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.996，方法检出限和方法定量限分别为0.02~0.15μg/kg和0.05~0.5μg/kg，整体回收率在64%~91%之间。在油煎条件下，经油煎5min后生成的6种杂环胺含量为9.50µg/kg。选用菜籽油、复合涂层锅、尺寸为4cm的加工条件生成的6种杂环胺含量最高，分别为47.62µg/kg、76.83µg/kg和29.62µg/kg。

　　关键词：杂环胺;加工条件;液相色谱;猪肉饼

　　杂环胺是富含蛋白质的食品在热加工过程中由蛋白质、氨基酸、糖类以及其他物质发生美拉德反应或裂解反应而生成的一类致癌、致突变化合物[1-2]。迄今已经从食品中分离和鉴定出的杂环胺约30种，主要常见于油炸、油煎、烧烤类肉制品中[3-4]。按照化学结构和生成途径的不同，杂环胺可分为两大类，分别为氨基咪唑氮杂芳烃类和氨基咔啉类，其中氨基咪唑氮杂芳烃类杂环胺在200℃以下的加热条件下就能够形成，而氨基咔啉类杂环胺一般在200℃以上由氨基酸或蛋白质受热降解生成[5]。人体若摄入过多含有杂环胺的食物，将有可能导致体内肝脏、胃肠道、膀胱、皮肤以及口腔等在内的多种器官产生病变[6]。因此，肉制品热加工过程中杂环胺的控制受到了众多相关研究人员的关注[7-9]。

　　肉制品中杂环胺的生成受到多种因素的影响，如肉的种类、烹调方式、加热温度和时间、前体物和脂质种类以及水分含量等，通过选择合适的烹调方式和加工条件能够一定程度的减少杂环胺的生成[10]。大量研究都表明，水煮等低温的烹饪方式相对于油炸等高温的烹饪方式会产生更少的杂环胺[11-16]。但由于油炸或者油煎过程能够提升肉的风味品质、增进食欲，因此油煎等烹饪方式深受消费者喜爱。加热温度和时间是影响杂环胺种类和含量的主要因素，降低加工温度、减少加工时间可有效降低杂环胺在肉制品中的含量[17]。虽然烹饪方式、加热温度、加热时间等因素对肉制品中杂环胺的影响研究已有较多报道[18-22]，但研究多集中在加工条件对氨基咪唑氮杂芳烃类杂环胺生成的影响，且加工锅具、食用油等热加工条件对肉制品中杂环胺种类和含量的研究还相对较少[23-24]。

　　因此，本实验以2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(MeAαC)、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]-吲哚(Trp-P-1)和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-2)6种氨基咔啉类杂环胺为研究对象，首先建立了一种同时测定猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法。重点研究了加工条件(如油煎时间、油的种类、锅具、肉饼尺寸等)对6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响，以期为烹饪条件的合理选择和肉制品热加工过程中杂环胺的减控提供数据支撑和方法指导。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2这6种氨基咔啉类杂环胺标准品(纯度均大于0.995)均购自上海安谱公司;甲醇为色谱纯，购自美国Merck公司;乙腈为色谱纯，购自美国Merck公司;甲酸为色谱纯，购自美国CNW公司;乙酸铵为色谱纯，购自CNW公司;氨水为分析纯，购自中国国药化学试剂公司;氢氧化钠、氯化钠为分析纯，购自广州化学试剂厂;实验用水均为超纯水。分别称取各标准品适量，用甲醇溶解并定容，配成单标储备液;再用甲醇稀释，配制成质量浓度为1.0mg/L的混合标准溶液。使用时，用流动相(1mmol/L乙酸铵(含0.05%甲酸)/乙腈，95/5)配制成不同浓度的混合标准工作液。猪肉样品为排酸后的冷鲜猪肉，购自广州市海珠区家乐福超市。

　　1.2仪器与设备

　　Ulimate3000超高效液相色谱仪，美国ThermoFisherScientific公司;QExactiveFocus四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱，美国ThermoFisherScientific公司;MS3digital涡旋混合器，美国IKA公司;Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司;N-EVAP112水浴氮吹仪，美国OA公司;KQ-500E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;KDC-40低速离心机，安徽中科中佳公司。

　　1.3方法

　　1.3.1猪肉饼的制备

　　去除样品肉中可见脂肪及筋膜后放置进绞肉机制成肉糜，搅拌均匀后，称取40g肉糜置于不同直径(4、6、8、10cm)的培养皿中，制成圆形肉饼。将培养皿置于4℃的冰箱中腌渍6~8h备用。

　　1.3.2样品前处理

　　称取1g待测样品于50mL离心管中，加入4mL1.0mol/L的NaOH溶液和6mL乙腈溶液，均质30s后加入1.5的NaCl，涡旋2min，4500r/min离心5min，将上层溶剂转移到15mL玻璃管中，残渣中再加入4mL乙腈萃取1次，合并乙腈层，在40℃下氮吹至约2mL，待净化。

　　预先用3mL甲醇、3mL蒸馏水、3mL1%甲酸溶液将StrataTM-X-C固相萃取柱活化和平衡。将提取液全部通过StrataTM-X-C固相萃取柱(60mg/3mL，Phenomenex公司)。依次用3mL0.1%甲酸、3mL水和3mL甲醇淋洗，再用4mL比例分别为90:10(V/V)的甲醇-氨水溶液进行洗脱，洗脱液在40℃下氮吹至干，用1.0mL流动相定容(涡旋30s)，0.22μm的PETE滤膜过膜，待UPLC-Q-OrbitrapHRMS检测。

　　1.3.3杂环胺测定条件

　　色谱条件：色谱柱为AgilentPoroshell120-EC-C18(150mm×2.1mm，2.7μm)，柱温为30℃;流动相：A相：1mmol/L乙酸铵溶液(含0.05%乙酸);B相：乙腈;梯度洗脱程序：0~1min，90%A;1~6.5min，90%A~80%A;6.5~7.5min，80%A~5%A;7.5~9.0min，5%A;9.0~10min，5%A~90%A;10~12min，90%A。进样量：5μL;流速：0.3mL/min。

　　质谱条件：QExactiveFocus质谱系统里有HESI离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV，毛细管温度320℃，喷雾温度250℃。鞘气压力设为45arb，辅助气压力是8arb，S-lensRF50V电压。氮气组成了喷雾气和碰撞气。使用校正溶液，对质量轴实施每7d校正1次。利用正离子FullMS模式进行扫描。FullMS一级全扫描范围为m/z50~650，分辨率为70000，自动增益控制AGC设置为1.0e6，自动注入时间IT为100ms;dd-MS2数据的获取需要二级扫描AGC，其值设为1.0e5，分辨率为17500，IT为60ms，各化合物的归一化碰撞能量(NCE)设为80%、100%、120%，动态排除设为8s。

　　1.4数据处理

　　数据采用SPSS21.0软件(美国SPSS股份有限公司)进行统计学分析，ANOVA进行方差分析，Duncan对提取条件进行显著性分析。以上所有实验均有重复，每个数据平行测定3次，结果表示均以实验数据的平均值±标准差的形式呈现。数据处理软件，MicrosoftExcel2003;图表绘制软件使用Origin8.1软件进行处理。

　　2结果与分析

　　2.16种氨基咔啉类杂环胺LC-Q-OrbitrapHRMS测定6种氨基咔啉类杂环胺在ESI+模式下均得到[M+H]+的准分子离子峰。根据获得的6种氨基咔啉类杂环胺的一级高分辨质谱图，以及从提取一级母离子中获取的提取离子色谱图，得到6种氨基咔啉类杂环胺的分子母离子的准确测定值和理论值、质量精确度和保留时间(表1)，可见6种氨基咔啉类杂环胺的质量偏差的绝对值均小于3.0，完全符合欧盟指令2002/657/EC中的定性确证准则。根据保留时间与准确分子质量可实现对6种氨基咔啉类杂环胺的准确定性。

　　2.2方法性能

　　以3倍信噪比确定方法检出限，以10倍信噪比确定方法定量限。以目标物定量离子的峰面积比值为纵坐标，以化合物浓度为横坐标进行回归分析，得到各化合物的线性回归方程、线性范围和检出限，见表1。MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2这6种氨基咔啉类杂环胺在各自的质量浓度范围内(线性范围在0.2~200μg/L之间)，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，线性方程分别为y=-0.163+1.037x、y=0.181+1.119x、y=0.012+0.488x、y=0.035+0.771x、y=-0.125+0.788x和y=-0.026+0.112x，相关系数R2≥0.996。方法检出限在0.02~0.15μg/kg之间，定量限在0.05~0.5μg/kg之间，表明方法具有较好的灵敏度。方法的基质效应在0.93~1.16之间，基本可以忽略。

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　　2.3前处理条件的优化

　　2.3.1NaOH溶液浓度的确定

　　杂环胺结构上的氨基或环上的氮原子具有不同的pKa值，这使得6种氨基咔啉类杂环胺的pKa值存在较大差异(MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2的pKa值分别为7.08、6.79、8.62、7.85、10.88和10.59)，提取溶剂的选择需要能够同时兼顾不同非极性的杂环胺。此外，肉制品富含油脂，应尽量减少油脂的干扰。通过分析发现，极性过强的甲醇，会共提取出样品中较多油脂等杂质，提取溶液呈黏稠状，固相萃取净化时容易堵塞固相萃取柱，增加后续净化难度[25]。二氯甲烷和乙酸乙酯对杂环胺类化合物回收率较低，大部分目标杂环胺的回收率低于30%。而乙腈的优点则是极性范围大，其分子较小，因而具有较强的组织穿透能力，拥有良好的沉淀效果，尤其是对脂肪、蛋白质类化合物，此外对6种氨基咔啉类杂环胺类化合物均有较高的提取率，提取溶液氮吹浓缩后底物较少。适当引入碱性水溶液有利于样品的分散，使目标化合物更充分地被提取出来。因此，本文考察了0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mol/L等不同浓度的NaOH溶液对目标杂环胺的提取效率，结果见图1a。在碱性条件下，随着NaOH浓度的增大，6种氨基咔啉类杂环胺的回收率整体呈现上升趋势，在1mol/L的浓度时回收率最佳，目标杂环胺的回收率均在68%以上，且实验过程观察到，在1mol/LNaOH溶液提取时，提取溶液在氮吹浓缩时出现的浑浊度最弱，氮吹浓缩后底物更少，基质效应低，表明提取出的油脂最少，原因可能是碱的加入使部分油脂皂化水解，起到一定的除脂效果[26]。但提取体系NaOH浓度过高(2mol/L)时，则容易出现乳化，不利于分层，影响了目标物在乙腈层的分配，从而降低了杂环胺的提取回收率。故最终采用乙腈溶液搭配1mol/L氢氧化钠溶液作为提取溶剂。

　　2.3.2NaCl添加量的确定

　　有研究发现，萃取过程中，添加1gNaCl的盐析效果对杂环胺的萃取效率有显著影响，而超过添加1gNaCl的盐析效果并没有显著提高[27]。因此，本实验研究了不同NaCl添加量(0、1.0、1.5、2.0、3.0g)对6种氨基咔啉类杂环胺提取效果的影响，结果见图1b。当NaCl添加量为0g时，6种氨基咔啉类杂环胺中只有MeAαC的回收率在60%以上，其余的均在60%以下，表明不添加NaCl时，目标杂环胺的提取效果较差。当添加1.0gNaCl时，杂环胺的提取回收率显著提高，但AαC、Trp-P-1这两种杂环胺的回收率仍低于70%。当NaCl添加量从1.0g增加到1.5g时，6种氨基咔啉类杂环胺的提取回收率达到最大值。随后，当NaCl添加量从1.5g继续增加到2.0g时，大多数杂环胺的提取回收率变化不显著。因此，最终选择添加1.5g的NaCl，以获得较优的目标杂环胺的提取回收率。

　　2.3.3固相萃取柱的选择

　　比较3种阳离子交换型固相萃取柱(StrataTM-X-C(60mg/3mL，Exomenex公司)、CleanertPCX(60mg/3mL)、WatersOasisMCX小柱(60mg/3mL))对6种氨基咔啉类杂环胺提取回收率的影响。按照固相萃取柱填料的吸附原理优化各自的上样溶液、淋洗和洗脱溶液，6种氨基咔啉类杂环胺的提取回收率结果如图1c所示。由图1可知，采用StrataTM-X-C净化，6种氨基咔啉类杂环胺均可获得较好的效果，回收率在70%以上，仪器检测显示基质抑制效应降低。这是因为StrataTM-X-C是键合了苯磺酸官能团的强阳离子交换柱，与杂环胺上的-N+可形成较强的离子键，然后可以用水和甲醇充分淋洗进行除杂，提高目标杂环胺的提取回收率。采用CleanertPCX柱和WatersOasisMCX柱净化，仪器检测显示基质抑制效应较强，目标杂环胺的回收率较低。综上所述，最终采用StrataTM-X-C固相萃取柱对提取溶液进行净化。

　　2.3.4洗脱液的确定

　　本实验还研究了甲醇-氨水混合洗脱液中两者的体积比(95:5、90:10、80:20和70:30)对6种氨基咔啉类杂环胺提取回收率的影响，结果如图1d所示。当氨水比例从5%增加到10%时，除了AαC、Trp-P-2，其他目标氨基咔啉类杂环胺的提取回收率显著增加，并达到最佳，而当氨水比例进一步增加到20%和30%时，杂环胺的回收率呈现显著降低的趋势。在90:10(V/V)的甲醇-氨水洗脱液下，杂环胺的整体回收率在64%~91%之间，优于95:5(V/V)、80:20(V/V)和70:30(V/V)甲醇-氨水洗脱液的整体回收率。因此，本文最终采用4mL90:10(V/V)甲醇-氨水作为固相萃取柱的洗脱液。

　　综上，最终确定的6种氨基咔啉类杂环胺的最优提取和净化条件为：1mol/LNaOH溶液-乙腈提取、添加1.5gNaCl、StrataTM-X-C柱净化、90:10(V/V)的甲醇-氨水洗脱。

　　2.4油的种类对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的影响

　　将上述制备的猪肉饼(直径8cm)置于平底不粘锅中煎制，固定油煎温度为225℃，加工5min(2.5min翻面)，考察玉米油、花生油、菜籽油、橄榄油、大豆油等5种家庭常用油对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响，结果如表2所示。不同的油品对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成具有显著性差异，橄榄油煎制的猪肉饼中杂环胺生成量(4.37μg/kg)低于其他4种家庭用油煎制的猪肉饼中杂环胺生成量。这可能是因为相比于玉米油、花生油、菜籽油、大豆油，橄榄油中含有更丰富的多酚等抗氧化物质，这些物质可通过清除杂环胺形成途径中涉及的自由基从而抑制杂环胺的生成[24]。也有一些学者研究发现橄榄油、葵花籽油和榛子油等对杂环胺形成能起到抑制效果，原因可能是这几种油中含有的不饱和脂肪酸较多，会对杂环胺形成过程中的美拉德反应造成干扰，破坏反应的进行，因此起到抑制杂环胺形成的效果;也有一些学者认为是由于其中的共轭亚油酸具有较强的抗氧化作用，从而对杂环胺的形成产生抑制作用[28]。

　　2.5油煎时间对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的影响

　　将上述制备的猪肉饼(直径8cm)置于平底不粘锅中，使用花生油煎制，固定油煎温度为225℃，考察不同油煎时间(1min、2min、3min、4min、5min)对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响，结果如表3所示。油煎时间对猪肉饼中杂环胺的产生具有显著的影响，随着油煎时间的增加，Trp-P-2、MeAαC和Norharman3种杂环胺的生成量都显著(P<0.05)增加。Dong等研究也发现230℃煎炸16min牛肉馅饼中Norharman和Harman的含量分别约为煎炸4min样品的18倍和12倍[29]。——论文作者：董浩1,2,3，徐燕1，吴家大1，冼燕萍4，杨娟1,2,3，于立梅1,2,3，钱敏1,2,3，曾晓房1,2,3*，白卫东1,2,3※

文章名称：油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的检测方法及加工条件对其生成的影响

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